| ekha kusumawati

08.17 |

PENGECATAN BAKTERI

1. Pengecatan Neisser

Pada pengecatan ini di gunakan untuk mengidentifikasi adanya bakteri Corynebacterium diphteriae

© Prinsip: pengecatan dengan Neisser A&B menyebabkan granula Babes Ernst (poolkarrel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri dipegang kuat terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser C tidak berubah (luntur), badan bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser C sehingga mengambil warna kuning atau coklat dari Neisser C.

· Cat Neisser A, B, dan C

· Kertas saring

· Minyak imersi, Xylol

· Formalin 1%

· Spesimen kapas lidi dari usapan tenggorok

· Obyek glass

· Pipet Pasteur

· Mikroskop

· Tabung besar

1. Pembuatan sediaan

Bersihkan obyek glass dengan kapas. Bebaskan dari lemak dengan cara melewatkan di atas lampu spiritus sampai terlihat uap air menghilang. Tunggu sampai dingin (3 menit). Tetesi sedikit formalin. Ambil spesimen kapas lidi dari usapan tenggorok, usapkan merata pada obyek glass yang ada formalin secara melingkar 1-1,5 cm. Tunggu sampai cukup kering.

2. Fiksasi

Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan di atas lampu spiritus (jarak api dengan obyek glass 10-15 cm) beberapa kali, sampai sediaan menjadi kering tetapi tidak sampai terlalu panas agar bentuk dan susunan bakteri tidak rusak karena panas. Pada tahap ini sediaan siap dicat.

3. Pengecatan

· Genangi sediaan dengan campuran cat Neisser A dan Neisser B (perbandingan 2:1) selama 0,5 menit.

· Cuci dengan Neisser C dengan posisi preparat miring sampai cat Neisser A dan B hilang.

· Genangi dengan cat Neisser C selama 3 menit.

· Buang larutan cat tanpa dicuci.

· Keringkan dengan menghisap cat menggunakan kertas saring.

· Biarkan dalam udara kamar dengan posisi miring sampai kering.

Bakteri golongan Diphterie, poolkarrelnya ungu kehitaman dengan badan bakteri berwarna coklat atau kekuningan biasanya ditemukan dengan berbagai susunan yang menyerupai huruf V, L atau Y

Hasil pengecatan Neisser hanya bersifat diagnosa sementara, untuk kepastian diagnosa dilakukan kultur dan tes virulensi baik secara invivo maupun invitro. Kultur Corynebacterium diphteriae. Spesimen ditanam pada media Loffler Serum, inkubasi 37°C selama 24 jam

Koloni pada media Loffler Serum dicat Nesser kemudian ditanam pada media CTBA inkubasi 37°C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dimurnikan pada Loffler Serum, inkubasi 37°C selama 24 jam. Lanjutkan penanaman Biokimia Reaksi untuk penentuan tipe (Gravis, Intermedius & Mitis).

2. PewarnaanSchaeffer- fulton

Cairan atau padatan (koloni)

Ose

obyek glass

Deck glass

Pembakar spiritus

Mikroskop

Reagent Malachiet green 5 %, terdiri dari:

· Malachiet green 5 gram

· Aguades 100 ml

Safranin 0,5 %, terdiri dari:

· Safranin 0,5 gram

· Alkohol 96 % 10 ml

· Aguades 90 ml

1. Preparat dicat dengan Malachite Green 5% dan dipanasi selama 30-60detik, biarkan selama 5 menit.

2. Cuci dengan air.

3. Preparat dicat dengan Safranin 0,5% selama 30 detik.

4. Cuci dengan air. Keringkan

Spora berwarna hijau, bakteri berwarna merah.

3. Pewarnaan Spora Bakteri Metode Klien

¨ Tujuan : Untuk melihat adanya spora bakteri dengan cara pewarnaan Klein

¨ Prinsip

¨ Alat dan Bahan :

- Cairan atau padatan (koloni)

- Ose

- Obyek glass

- Deck glass

- Pembakar spiritus

- Mikroskop

- Reagent : 1. Karbol fuhsin

§ Larutan jenuh Fuhsin dalam alkohol 10 ml

§ Fenol 5 % 90 ml

- Metilen biru

§ Metilen biru 1,48 gram

§ Alkohol 100 ml

¨ Prosedur :

1. Buatlah suspensi kuman ,tambahkan karbol fuhsi sama banyak (perbandingan 1:1)

2. Dipanaskan campuran tersebut selama 6 menit atau dipenangas air 80^o C selama 10 menit

3. Dibuat sediaan dari suspensi tersebut lalu difiksasi

4. Kemudian ditetesi larutan H2SO4 1 % biarkan selama 2-3 detik

5. Cuci dengan air kran pelan-pelan

6. Ditetesi dengan larutan metilen biru selama 2-4 menit

7. Dicuci dengan air kran pelan-pelan dan keringkan

8. Setelah kering tetesi dengan oil emersi

9. Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X

10. Setelah selesai bersihkan lensa mikroskop dengan xylol

¨ Pembacaan hasil pewarnaan:

Badan bakteri berwarna biru dan spora berwarna merah.

5. Pewarnaan Wayson Untuk Identivikasi Bakteri Yersinia pestis

Tujuan : Mahasiswa dapat mewarnai kuman Yersinia pestis dengan cara pewarnaan wayson.

Alat dan Bahan :

· larutan wayson

a. Basic fuchsin 0,3 gram

Alkohol 96 % 8 ml

b. Metilen biru 0,75 gram

Alkohol 96 % 12 ml

Larutan a+b ditambah fenol 5 % 10 ml dan aquades 180 ml

Cara Kerja

1. Dibuat sediaan,dikeringkan di udara

2. Difikasasi dengan methanol selama 5-10 menit

3. Ditetesi larutan wayson biarkan selama 10 20 detik

4. Dicuci dengan air kran pelan-pelan dan keringkan

5. Setelah kering tetesi dengan oil emersi

6. Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X

7. Setelah selesai bersihkan lensa mikroskop dengan xylol

Pembacaan hasil pewarnaan:

Bila positip bagian bipolar kuman berwarna biru sedangkan sisanya berwarna merah.

8. Metode pewarnaan Hiss

Tujuan : Untuk melihat/mengamati kapsul dari spesies bakteri tertentu dengan perwarnaan hiss, kapsul akan berwarna faint pink (merah jambu pucat), sedang sel bakteri berwarna ungu tua.

Alat dan Bahan

Dua kelompok spesimen/bahan pemeriksaan yang bisa digunakan dengan metode-metode pewarnaan tersebut:

a. Spesimen Klinik:

1) Cair (liquid) : urine, transudat, Eksudat, Cerebro spinal fluid, Synovial fluid dll

2) Semi/non-liquid : septum, pus, feces, sekret (mata, hidung, vagina dll)

b. Spesimen non-klinik

1) Cair (liquid) : suspensi bakteri, biakan bakteri dalam medium cair

2) Non-liquid : biarkan bakteri pada pembenihan padat (ditabung ataulempeng petri)

Cara Kerja

1. Pembuatan Preparat

· Spesifik klinik cair (liquid)

1) Kocok spesimen dalam tabung/botolnya agar tercampur baik.

2) Pipet sejumlah volume (5 – 10 ml) spesimen ke dalam tabung centrifuge

3) Putar selama 10 menit dengan kecepatan 3 x 103 rpm

4) Buang supernatan dan buat smear dari defesitnya pada sebuah objek gelas yang kering dan bersih.

5) Keringkan smear di udara dan kemudian lidah apikan (flaming) beberapa kali pada nyala pembakar bunsen atau lampu spirtus guna lebih melekatkan smear pada permukaan gelas dan mematikan mikroba.

6) Sediaan/preparat siap untuk diubah.

· Spesimen klinik non-liquid

1) Dengan sengklit yang steril (sebelumnya sampai memijar pada nyala lampu spirtus), ambil spesimen secukupnya kemudian buatlah smear pada sebuah objek gelas yang bersih dan kering.

2) Usahakan smear itu setipis mungkin

3) Keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala bunsen

4) Preparat siap diubar.

· Spesimen non-klinik cair

1) Dengan sengkli steril ambil sedikit biakan cair dari tabung dan buat smear setipis mungkin pada objek gelas yang bersih dan kering.

2) Keringkan di udara dan kemudian lidah apikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen.

3) Sediaan/preparat siap diubar

· Spesimen non-klinik non-liquid

1) Dengan sedikit steril ambil 1-2 koloni dari plate solid culture medium atau sedikit pertumbuhan dari tabung pembenihan agar miring dan suspensikan dalam aquadest pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering.

2) Buatlah smear dengan suspensi tersebut setipis mungkin

3) Keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen

4) Sediaan/preparat siap diubar

2. Pengecatan

1) Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari lemak

2) Buat smera dari biakan yang ada secara aseptik.

3) Preparat tersebut dikering uadarakan

4) Lakukan fiksasi di atas lampu spirtus

5) Letakkan preparat smear pada rak pengecatan lalu tetesi dengan 2-3 tets basic fuchin dan lalu dipanaskan di atas nyala lampu spirtus sampai timbul uap, jaga jangan sampai mendidih atau menjadi kering, lalu dinginkan.

6) Cuci dengan larutan CuSO₄.5H₂O 20%

7) Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap air yang tersisa pada permukaan preparat dengan kertas serap

8) Amati preparat dengan perbesaran kuat (pakai minyak imersi)menggunakan mikroskop.

Intepretasi hasil

Sel vegetative: ungu – merah tua. Kapsul : biru pucat.

7. Pengecatan Bartolomew-Mittwer

· Tujuan: Untuk mengetahui adanya dan letak spora pada sel bakteri.

· Alat dan bahan

- Gelas benda, lampu spirtus, mikroskop

- Jarum ose

- Akuadest steril

- Biakan murni : staphilococcus aureus, bacillus subtilis